細胞凍存技術

實驗室低溫保存設備包括：液氮保存箱、液氮罐、-140℃/-150℃深冷低溫保存箱、-86℃超低溫冰箱、程控降溫儀、低溫冰箱（-20℃、-30℃、-40℃）、藥品保存箱、疫苗保存箱、血庫冰箱、層析柜、防爆冰箱、防火冰箱等。

檢驗冰箱可靠性和制冷能力的方法：1、常規冰箱放置溫度計；2、超低溫冰箱放置加熱器、大量樣品或反復開門
 
 1. 凍存保護劑
很多化合物都可以作為凍存保護劑，它們既可以單獨使用也可以聯合使用，例如糖、血清和去污劑。雖然凍存沒有的準則，但是大家普遍認為二甲基亞砜（DMSO）和甘油是保護活細胞和組織使用廣泛且有效的凍存保護劑。其他凍存保護劑可根據情況使用，可單獨使用也可聯合使用，包括：聚乙烯乙二醇（polyethylene glycol），丙烯乙二醇（propylene  glycol），甘油（glycerine），聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrolidone），山梨醇（sorbitol），右旋糖苷（dextran），海藻糖（trehalose）。

凍存組織和整個器官的需求，促進了凍存方法的發展，新方法也提高了凍存細胞和有機體的復蘇。這些方法包括改變凍存保護劑的濃度和加入添加劑，避免凍存過程引發的細胞調亡或 程序性死亡。多年來人們一直認為，是凍存過程中產生的細胞內物理變化或損壞，造成凍存后細胞的死亡。而近有研究發現，一些更為精細的胞內活動可能導致了細胞死亡，而這些活動可在一定程度上受控于適當的凍存添加劑。

凍存過程中，凍存保護劑有多種功能。例如，DMSO 可以降低冰點，促進細胞在胞內冰晶形成之前脫水更加*。普遍認為，當凍存保護劑可有效穿透細胞，延遲胞內冰晶形成，降低溶液效應時，凍存保護的效果不錯。另外，需要根據凍存的細胞類型來選擇凍存保護劑。對絕大多數細胞來說，甘油是更好的選擇，因為它的毒性比DMSO 小。但是，DMSO 具有更好的滲透性， 通常作為較大型較復雜的細胞凍存，如原生生物。在添加到細胞懸液之前，凍存保護劑應該用新鮮培養基稀釋到適宜濃度，這能小化潛在的化學反應損害，并確保細胞能均一接觸到保護劑，減少毒害效應。DMSO 和甘油通常使用的濃度范圍為 5-10%（v/ v）。除了用于植物細胞，二者一般不聯合使用。

凍存保護劑濃度選擇根據細胞類型及細胞所能耐受的濃度而定。針對某些材料，通過不斷增加保護劑濃度來檢測細胞的敏感度，有助于挑選出保護劑的工作濃度。Quick- Reference Chart（第4 頁）羅列出針對不同類型細胞所使用保護劑的推薦濃度，并且可以作為選擇合適保護劑的參考資料。

2. 生物材料準備
生物材料凍存前進行的準備工作可能會對凍存結果產生影響。對于非復制性材料，如組織，核酸和蛋白等，準備過程包括確認生物材料處于合適的溶液或凍存培養基中，此步驟的目的在于復蘇時達到大化的預期用途。然而，活細胞和微生物的穩定性及復蘇活力受生長條件和凍存前準備工作的影響。

細胞凍存前需考慮多種因素，包括細胞類型、活力、生長條件、生理狀態、數目以及細胞前處理等。當建立一個新分離株或細胞系的初次種子儲備時，必須對培養物進行檢測并消毒，確保微生物污染的小化。每次準備工作后，以及每次準備新批次的培養物時，均要重復這個步驟。

2、1 微生物
生長于通氣培養條件下的微生物細胞，特別是細菌和酵母，表現出比生長于非通氣條件下的細胞更強的耐受冷卻和凍存傷害 的能力。T.Nei 認為，在通氣培養條件下，細胞通透性更好，且開放條件下培養細胞在冷卻過程中比非通氣條件下培養的細胞失水更快。另外，針對微生物細胞，在對數生長期后期及穩定期早期獲得的細胞表現出更強的冰凍耐受性。從生長后期和靜態培養早期收集的微生物細胞比生長早期和生長晚期的細胞表現了更強的冰凍耐受性。

一般來講，初始凍存的細胞數目越多，復蘇率越高。對于大多數細菌和酵母而言，保證約 107/ml 的細胞數才能確保足夠數量的細胞復蘇。由于這些細胞可便捷地從瓊脂培養板或斜面上收集，如果需要更大量的細胞，也可使細胞生長于液體培養基中通過離心收集，在任何一種情況下，細胞通常懸浮在包含凍存保護劑的新鮮培養基中。原生生物可以通過離心濃縮，但通常需要懸浮于使用的培養基中，之后使用等體積含凍存保護劑的新鮮培養基稀釋。

針對芽孢菌凍存，需要收集芽孢并重懸于含凍存保護劑的新鮮培養基中。凍存前，必須縮短操作時間且確保芽孢并未萌發。針對非芽孢菌凍存，凍存前需采用特殊程序收集菌絲體。某些具硬菌絲體的真菌，需將含有菌絲體的瓊脂塊從培養基中切出，并將其置于含凍存保護劑的新鮮培養基中。硬菌絲體無法與瓊脂培養基很好粘附，生長于肉湯培養基中時，凍存前需將菌絲體團進行混合。

凍存材料的活力和復蘇率由凍存前后的培養和生長狀態決定。活力是衡量培養物生長和繁殖的一項指標。例如原生生物材料等某些材料，需經過多次傳代才能保證其穩定性。復蘇細胞數量的估算有多種方法，包括連續稀釋，平板計數或直接細胞計數。通過對比凍存前和復蘇后細胞數量的差異，可說明細胞復蘇程度 或凍存過程是否成功。

2、2 哺乳動物細胞
哺乳動物細胞準備凍存時，需要將細胞調整到合適生長狀態， 確保既能得到足夠的復蘇細胞又無大量非必需生長的細胞。對大部分哺乳動物細胞來說，起始細胞數為 106-107/ml 左右。為方便加入等體積的凍存保護劑（2× 凍存保護劑 + 培養基），細胞懸液濃度應以起始濃度的兩倍準備。或者，也可將沉淀細胞重懸在凍存 保護劑（1× 凍存保護劑 + 培養基）中達到預期細胞數。細胞操作應該溫和小心，確保細胞在凍存前是健康的。盡量避免劇烈吹打及 高速離心。適當情況下，可注入 5% 或 10% CO2 來調節 pH。
影響哺乳動物細胞復蘇的因素包括：（a）細胞類型，（b）生長階段，（c）細胞處于細胞周期的哪個階段，（d）終懸液中的細胞數量和濃度。可通過優化以上因素來提高復蘇細胞活力， 另外，還需考慮凍存保護劑的特性以及凍存過程的具體操作。

哺乳動物細胞培養對其他細胞和微生物的污染特別敏感，例如 Hela 細胞。由于這種特性，初始細胞系可通過同工酶分析、染色體組型分析、免疫分析或基因組分析，檢測來源。凍存前后均應該進行如上檢測。特別需要注意的是，病毒和支原體污染。 一套完整健全的哺乳動物細胞系鑒定程序應該包括，檢查是否存 在細菌、真菌、病毒、支原體、甚至原生生物細胞的污染。

2、3 干細胞
干細胞的凍存方式與哺乳動物細胞大體類似，除了部分提高復蘇和克隆生長活性的步驟。一般使用 DMSO 為凍存保護劑，有時配合使用血清，推薦緩慢降溫方式凍存。海藻糖與其它凍存保護劑聯合使用，降低對細胞的潛在傷害。同時，推薦快速升溫方式復蘇。復蘇的細胞活力依據細胞類型不同可能呈現不同水平。

玻璃化（Vitrification）也可被用于凍存干細胞。操作流程包括，懸浮細胞于包含多種凍存保護劑的濃縮混合物中。另外，需要降溫凍存和復蘇過程的操作均十分快速，避免冰晶的形成。一些研究證明，玻璃化可得到更高的細胞活力。DMSO，甘油和丙二醇為常用的有效凍存干細胞的保護劑。

2、4 植物細胞
植物細胞凍存與其它細胞相似。細胞的生長階段會影響復蘇效果，適合的生長階段為對數生長期后期。另外，細胞密度也大大影響復蘇效果，合適細胞密度取決于細胞類型。
聯合使用凍存保護劑大多數情況下比單一使用效果更好。降溫速率很重要，在很多情況下，兩步降溫法*，即先將細胞在 -30℃ --40℃凍存一段時間再降溫到液氮溫度。這種方法增強了凍存前的胞質失水。通常推薦快速回溫方式復蘇，但是在某 些情況下緩慢回溫方式復蘇效果更好。通過使用濃縮細胞懸液和快速降溫，植物細胞也可使用玻璃化方式凍存。

植物的抗逆性培養使得其對于壓力環境有更強的耐受性，例如凍存過程。植物可產生一定數量的化合物，例如糖類或甘油，保護細胞減少滲透壓改變造成的傷害。未分化愈傷組織凍存通常是為了獲得穩定性狀，這些性狀會被持續培養所影響。

種子保存也是一種保存穩定植物種質（germplasm）的方法， 普遍的方法為保存于低濕低溫處。然而，有些種子可耐受由凍存引發的失水，這樣的種子便可凍存于液氮溫度中。

2、5 病毒
大多數病毒可以無準備階段直接凍存，且無需進行降溫控制。但是，與寄主細胞同培養的病毒，在凍存過程中需要進行降溫控制。就寄宿細胞的病毒而言，應采取適當的凍存操作以保證宿主細胞的活力。當從卵細胞中獲得病毒時，尿囊液或卵黃囊中的高蛋白物質可在凍存過程中對其提供保護。

植物病毒的保存既可以通過感染植物組織的方式，也可以是純病毒制劑形式。病毒準備是在凍存前將其懸浮于 DMSO 或其它 凍存保護劑中。雖然絕大部分植物病毒可耐受快速降溫，但適當控制降溫速率，可得到很好復蘇效果。直接在溫水浴中浸泡便 可對植物病毒進行復蘇，之后將復蘇病毒接種于合適植物寄主即可。

2、6 胚胎
胚胎可通過控制降溫速率和玻璃化兩種方式進行保存。復蘇取決于胚胎發育的階段，通過成功植入并進入胎兒發育來衡量復蘇效果。

2、7 非復制性材料
非復制性材料，例如全血、血清、組織、核酸和蛋白質，對于材料的凍存并無特殊要求。這些材料一般直接凍存，不加凍存保護劑，且采用快速降溫。然而，對于這些材料的實際凍存操作方式的選擇取決于材料終的使用目的。要在復蘇后成功保留全血的特性，需要凍存保護劑和降溫控制，而凍存組織的質量提高可以通過使用切割溫度（OCT）復合物材料等物質進行懸浮。