我們可能都有過(guò)這樣的經(jīng)歷：

辛苦呵護(hù)的細(xì)胞，怎么也不愿意貼壁；

貼壁了又很容易成塊或者成團(tuán)掉下來(lái)；

原本貼壁的細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞不貼壁了；

........

遇到這樣的問(wèn)題你都如何解決？

這次我們就來(lái)聊聊

什么是貼壁細(xì)胞？

貼壁細(xì)胞原理？

細(xì)胞貼壁和什么有關(guān)？

為啥你的細(xì)胞不愿貼壁呢？

如何促進(jìn)細(xì)胞貼壁？
 

根據(jù)細(xì)胞特性分類(lèi)

1、 懸浮細(xì)胞（Suspension Cell）

細(xì)胞生長(zhǎng)不依賴(lài)支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，如淋巴細(xì)胞。

2、 貼壁細(xì)胞（Adherent Cell）

在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，必須有可以貼附的支持物表面，依靠自身分泌或培養(yǎng)基中的粘附因子才能在該表面生長(zhǎng)增殖的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞在該表面生長(zhǎng)后，一般形成兩種形態(tài)，即成纖維樣細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞。

▲ 細(xì)胞形態(tài)

3、 兼性貼壁細(xì)胞

有些細(xì)胞并不嚴(yán)格地依賴(lài)支持物，它們既可以貼附于支持物表面生長(zhǎng)，但在一定條件下，也可在培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。

貼壁細(xì)胞分為：上皮細(xì)胞型，成纖維細(xì)胞型，游走細(xì)胞型和多型細(xì)胞型，在顯微鏡下觀察時(shí)，貼壁細(xì)胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規(guī)則的三角形或扇形或其他形態(tài)，而且晃動(dòng)培養(yǎng)液時(shí)，細(xì)胞不動(dòng)。常見(jiàn)的貼壁細(xì)胞有成纖維細(xì)胞、骨骼組織（骨及軟骨）、心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺皮膚、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、黑色素細(xì)胞以及各種腫瘤細(xì)胞等。

體外培養(yǎng)貼壁細(xì)胞特點(diǎn)

貼附并伸展，是多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本生長(zhǎng)特點(diǎn)。細(xì)胞貼壁的過(guò)程使形態(tài)發(fā)生很大變化，細(xì)胞形態(tài)改變是細(xì)胞內(nèi)骨架（真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系，由微管、微絲及中間纖維組成的體系）本身和細(xì)胞外基質(zhì)共同作用的結(jié)果。培養(yǎng)細(xì)胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣，當(dāng)與底物貼附后，細(xì)胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)，呈成纖維細(xì)胞樣或上皮細(xì)胞樣等。細(xì)胞附著于底物時(shí)并非一種需要能量的過(guò)程，一般認(rèn)為與電荷有關(guān)。據(jù)資料記載，37℃時(shí)在2min內(nèi)細(xì)胞之間即可形成鍵，該鍵可對(duì)0.01%胰蛋白酶起作用且僅發(fā)生于細(xì)胞間，細(xì)胞與底物之間則無(wú)；8min后才有穩(wěn)定的鍵形成。

貼壁細(xì)胞（除腫瘤細(xì)胞外）在體外培養(yǎng)條件下，完成貼壁后均為單層生長(zhǎng)，原因是貼壁細(xì)胞有接觸性抑制的特點(diǎn)。一般認(rèn)為接觸抑制是細(xì)胞間的一種識(shí)別作用，對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)形成與穩(wěn)定具有重要性的作用。由于貼壁細(xì)胞的一面是緊貼在培養(yǎng)瓶上的，如果其上方存在細(xì)胞與其相粘附，那么下方的細(xì)胞很快就會(huì)缺乏營(yíng)養(yǎng)---餓死。

接觸抑制：

1954年，由艾伯克龍比發(fā)現(xiàn)，一些細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中達(dá)到相互接觸時(shí)停止分裂現(xiàn)象，將其命名為接觸性抑制（Contact Inhibition），后來(lái)證實(shí)接觸性抑制普遍存在于貼壁細(xì)胞之間。

接觸抑制的原理：細(xì)胞膜上有糖類(lèi)和蛋白質(zhì)共同構(gòu)成的糖蛋白，也叫做糖被，它在細(xì)胞上起識(shí)別作用，當(dāng)細(xì)胞增殖到一定程度，挨在一起時(shí)，糖蛋白就會(huì)識(shí)別這種信號(hào)，并且使細(xì)胞停止繁殖。

▲ 單層生長(zhǎng)

細(xì)胞為什么要貼壁

首先并不是所有的細(xì)胞在體外培養(yǎng)的情況下都會(huì)貼壁，但大部分來(lái)自實(shí)體組織器官的細(xì)胞都會(huì)貼壁。

密度大于培養(yǎng)基的細(xì)胞（絕大部分細(xì)胞）通過(guò)重力作用會(huì)沉降在底面上，這是種自然屬性，那么細(xì)胞要生存必定得改善這個(gè)環(huán)境，也是貼壁的主要原因-分泌細(xì)胞外基質(zhì)和粘附因子（Extracellular matrix& Cell Adhesion Molecules，ECM&CAM），改善底面的結(jié)構(gòu)，然后很自然就貼附在底面上了。

細(xì)胞粘附分子：

是眾多介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱(chēng)。

細(xì)胞外基質(zhì)：

是由動(dòng)物細(xì)胞合并分泌到胞外、分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子。

二者大多數(shù)均為糖蛋白，因此具有較強(qiáng)的親水性——因此能不能貼壁不僅僅關(guān)乎細(xì)胞是否有這種能力，也與有無(wú)合適的底物（培養(yǎng)瓶）有關(guān)。

▲ 原理圖（圖源網(wǎng)絡(luò)）

密度小于水的細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞，漂浮在液面上，所以不可能貼在底面上，但是如果將培養(yǎng)液加滿，那么細(xì)胞能夠與培養(yǎng)瓶上面的壁接觸同樣可以貼壁。因此可以說(shuō)，細(xì)胞貼壁是適應(yīng)環(huán)境的一種反應(yīng)。

細(xì)胞貼壁原理及相關(guān)因素

大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)和體外均附著于一定的底物而生長(zhǎng)，在體外時(shí)這些底物可以是其他細(xì)胞、膠原、玻璃或塑料等。

貼壁的過(guò)程：細(xì)胞首先分泌細(xì)胞外基質(zhì)，這種細(xì)胞外基質(zhì)黏附在支持物的表面（培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿的底面）。然后，細(xì)胞通過(guò)其表面表達(dá)的黏附因子與這些細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。

▲ 貼壁過(guò)程

一些特殊的促細(xì)胞附著物質(zhì)（如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅲ型膠原、血清擴(kuò)展因子等）可能參加細(xì)胞的貼附過(guò)程。這些促細(xì)胞附著因子均為蛋白質(zhì)，存在于培養(yǎng)液尤其是血清中。在培養(yǎng)過(guò)程中，這些帶陽(yáng)電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細(xì)胞再與已吸附的有促貼附物質(zhì)的底物附著，以后細(xì)胞將伸展成其原來(lái)的形態(tài)。所以細(xì)胞貼壁與否和細(xì)胞本身分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力以及細(xì)胞本身表達(dá)的黏附分子的數(shù)量有關(guān)，也與培養(yǎng)皿壁的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。

細(xì)胞不貼壁的一些原因

• 1. 胰酶消化時(shí)間把控不當(dāng)：消化不夠細(xì)胞本身就是成團(tuán)的；若胰酶處理太久，容易造成細(xì)胞膜蛋白損傷，使細(xì)胞貼壁不緊，顯微鏡下觀察立體感不強(qiáng)，嚴(yán)重的時(shí)候甚至?xí)斐杉?xì)胞死亡。

• 2. 缺少貼壁因子：血清中含有促貼壁因子，而無(wú)血清培養(yǎng)基工藝中由于缺少這種促貼壁因子，細(xì)胞的貼壁效果會(huì)下降很多。

• 3. 支原體或細(xì)菌的污染。

• 4. 培養(yǎng)液配制、儲(chǔ)存不當(dāng)，如pH值過(guò)堿，Gln量太少等原因。

• 5. 復(fù)蘇的細(xì)胞本身狀態(tài)不好，已經(jīng)老化，失去貼附性。

• 6. 接種細(xì)胞數(shù)目太少，無(wú)法分泌足夠的細(xì)胞外基質(zhì)。

• 7. 復(fù)蘇時(shí)處理速度太慢，復(fù)蘇過(guò)程不當(dāng)。
   

如何促進(jìn)細(xì)胞貼壁

• 1. 適度消化細(xì)胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細(xì)胞處理時(shí)間可適當(dāng)放長(zhǎng)，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細(xì)胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養(yǎng)基打散。

• 2. 用塑料瓶培養(yǎng)，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾膠原包被一下培養(yǎng)瓶，或者用鹽酸對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行蝕刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以幫助細(xì)胞貼附新的培養(yǎng)瓶，細(xì)胞不易貼壁，建議加多聚賴(lài)氨酸處理。

• 3. 正確配制消化液或培養(yǎng)液。

• 4. 使用合適的細(xì)胞外基質(zhì)或貼壁試劑。

• 5. 復(fù)蘇新的細(xì)胞，第1周用20%血清幫助細(xì)胞復(fù)原。

• 6. 傳代接種一定要鋪的均勻，避免細(xì)胞抱團(tuán)生長(zhǎng)。

• 7. 細(xì)胞傳代24小時(shí)之內(nèi)，不要晃動(dòng)，以免影響貼壁。

• 8. 體內(nèi)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在膠原構(gòu)成的基膜上，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上有利于生長(zhǎng)。人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)，可以用γ射線照射后的3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層，另外降低pH、Ca²⁺含量和溫度，均有利于上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。

  　　Countess3細(xì)胞計(jì)數(shù)儀雖然是一款高效的細(xì)胞計(jì)數(shù)工具，但它本身并不直接涉及細(xì)胞貼壁的問(wèn)題。

  　　細(xì)胞不貼壁是在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題，可能會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

  　　以下是關(guān)于細(xì)胞不貼壁的一些原因及可能的解決方案：

  　　細(xì)胞不貼壁的原因：

  　　培養(yǎng)基條件不適：

  　　pH值不適當(dāng)：理想的細(xì)胞生長(zhǎng)pH范圍通常在7.2到7.4之間。過(guò)高或過(guò)低的pH值都可能影響細(xì)胞貼壁。

  　　營(yíng)養(yǎng)不足：培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分不足或比例不適當(dāng)，可能導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法正常貼壁生長(zhǎng)。

  　　氧氣或二氧化碳濃度不適：特別是在CO2孵化器中，不恰當(dāng)?shù)腃O2濃度會(huì)影響培養(yǎng)基的pH值，從而影響細(xì)胞貼壁。

  　　細(xì)胞本身的問(wèn)題：

  　　細(xì)胞狀態(tài)不佳：如在傳代過(guò)程中受損或凍存復(fù)蘇過(guò)程中受到影響的細(xì)胞，可能活力下降，導(dǎo)致無(wú)法正常貼壁。

  　　細(xì)胞類(lèi)型特性：有些細(xì)胞類(lèi)型(如懸浮細(xì)胞系)自然不易貼壁，需要特殊的培養(yǎng)條件或添加特定的附著因子。

  　　培養(yǎng)容器問(wèn)題：

  　　容器表面處理不當(dāng)：細(xì)胞可能需要經(jīng)過(guò)特殊處理的表面才能有效貼壁，如膠原蛋白或纖維連接蛋白涂層。

  　　容器污染：微生物污染或化學(xué)污染也可能影響細(xì)胞的貼壁。

  　　操作技術(shù)：

  　　播種密度不當(dāng)：播種密度太低或太高都可能影響細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)。

  　　操作過(guò)程中的機(jī)械損傷：過(guò)度的吸吐或劇烈的震蕩可能會(huì)損傷細(xì)胞，導(dǎo)致其無(wú)法貼壁。

  　　解決方案：

  　　調(diào)整培養(yǎng)基條件：確保pH值、營(yíng)養(yǎng)成分和氣體濃度處于適宜范圍。

  　　優(yōu)化細(xì)胞狀態(tài)：選擇健康、活力好的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，避免使用受損或狀態(tài)不佳的細(xì)胞。

  　　選擇合適的培養(yǎng)容器：根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型選擇合適的培養(yǎng)容器，并確保其表面處理適合細(xì)胞貼壁。

  　　提高操作技術(shù)水平：避免在細(xì)胞操作過(guò)程中造成不必要的機(jī)械損傷，合理控制播種密度。

  　　引入附著因子：對(duì)于不易貼壁的細(xì)胞類(lèi)型，可以嘗試添加特定的附著因子來(lái)促進(jìn)細(xì)胞貼壁。

  　　使用懸浮培養(yǎng)方法：對(duì)于某些自然不易貼壁的細(xì)胞類(lèi)型，可以考慮使用懸浮培養(yǎng)的方法進(jìn)行培養(yǎng)。

  　　解決細(xì)胞不貼壁的問(wèn)題需要從多個(gè)方面綜合考慮，包括培養(yǎng)基條件、細(xì)胞狀態(tài)、培養(yǎng)容器和操作技術(shù)等。通過(guò)優(yōu)化這些條件和技術(shù)，可以有效地促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)。