FITC Annexin V 是一種用于識別凋亡細胞的靈敏探針，與帶負電荷的磷脂表面結合（Kd 約為 5 x 10^-2），對磷脂酰絲氨酸 (PS) 的親和力高于大多數其他磷脂。FITC Annexin V 結合是鈣依賴性的，如 FITC Annexin V 染色方案中所述，最佳染色需要確定的鈣和鹽濃度。  研究人員應注意，FITC Annexin V 對貼壁細胞類型（例如 HeLa、NIH 3T3 等）的流式細胞術分析并非常規測試，因為在細胞分離或收獲過程中可能會發生特定的膜損傷。然而，之前已經報道了利用膜聯蛋白 V 對貼壁細胞類型進行流式細胞術的方法（Casiola-Rosen 等人和 van Engelend 等人）。

喜樹堿誘導細胞凋亡

提供以下協議作為說明如何在細胞系 (Jurkat) 上使用 FITC 膜聯蛋白 V。

材料

1. 制備喜樹堿儲備液（Sigma-Aldrich 目錄號 C-9911）：1 mM DMSO 溶液。

2. Jurkat T 細胞 (ATCC TIB-152)。

程序

1. 將喜樹堿（最終濃度 4-6 µM）添加到 1 x 10^6 Jurkat 細胞中。

2. 在 37°C 下孵育細胞 4-6 小時。

3. 繼續使用 FITC Annexin V 染色方案來測量細胞凋亡。

FITC 附聯蛋白 V 染色方案

FITC Annexin V 用于定量確定細胞群中正在積極經歷凋亡的細胞百分比。它依賴于細胞在細胞凋亡的早期階段失去膜不對稱性的特性。在凋亡細胞中，膜磷脂磷脂酰絲氨酸 (PS) 從質膜的內葉轉移到外葉，從而將 PS 暴露于外部環境。Annexin V 是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白，對 PS 具有高親和力，可用于鑒定暴露于 PS 的凋亡細胞。碘化丙啶 (PI) 是一種標準的流式細胞儀活性探針，用于區分活細胞和非活細胞。具有完整膜的活細胞排除 PI，而死細胞和受損細胞的膜可滲透 PI。FITC Annexin V 染色呈陽性而 PI 呈陰性的細胞正在發生凋亡。FITC Annexin V 和 PI 染色呈陽性的細胞要么處于細胞凋亡的末期，要么正在發生壞死，要么已經死亡。FITC Annexin V 和 PI 染色均為陰性的細胞是活的，沒有發生可測量的細胞凋亡。

試劑

1. FITC Annexin V（成分編號 51-65874X）：每次測試使用 5 µl。

2. 碘化丙啶 (PI)（組分編號 51-66211E）是一種方便的即用型核酸染料。每次測試使用 5 µl。

3. 10X 膜聯蛋白 V 結合緩沖液（組分號 51-66121E）：0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4)、1.4 M NaCl、25 mM CaCl2。對于 1X 工作溶液，將 1 份 10X 膜聯蛋白 V 結合緩沖液稀釋至 9 份蒸餾水。

染色

1. 用冷 PBS 洗滌細胞兩次，然后以 1 x 10^6 個細胞/ml 的濃度在 1X 結合緩沖液中重懸細胞。

2. 將 100 µl 溶液（1 x 10^5 個細胞）轉移到 5 ml 培養管中。

3. 加入 5 µl FITC Annexin V 和 5 µl PI。

4. 輕輕渦旋細胞并在室溫 (25°C) 黑暗中孵育 15 分鐘。

5. 向每管中加入 400 µl 1X 結合緩沖液。在 1 小時內通過流式細胞儀進行分析。

設置流式細胞術的建議控制

以下控件用于設置薪酬和象限：

1. 未染色的細胞。

2. 用 FITC Annexin V（無 PI）染色的細胞。

3. 用 PI 染色的細胞（無 FITC Annexin V）。

其他染色對照：

應使用易于誘導細胞凋亡的細胞系來獲得 FITC 膜聯蛋白 V 和/或 FITC 膜聯蛋白 V 和 PI 的陽性對照染色。重要的是要注意細胞凋亡和壞死的基礎水平在人群中有很大差異。因此，即使在沒有誘導細胞凋亡的情況下，大多數細胞群也會包含一小部分細胞凋亡陽性（FITC Annexin V 陽性，PI 陰性或 FITC Annexin V 陽性，PI 陽性）。

未處理的群體用于定義凋亡和死細胞的基礎水平。然后通過從處理過的細胞群中凋亡細胞的百分比中減去未處理過的細胞群中凋亡細胞的百分比來確定已經被誘導經歷細胞凋亡的細胞的百分比。由于細胞死亡是細胞經歷凋亡的最終結果，處于凋亡后期的細胞將有受損的細胞膜，并且 PI 和 FITC 膜聯蛋白 V 染色呈陽性。因此，該測定無法區分已經經歷過凋亡的細胞凋亡細胞死亡和那些因壞死途徑而死亡的細胞，因為在任何一種情況下，死細胞都會被 FITC Annexin V 和 PI 染色。

準備和存儲

在 4°C 下未經稀釋儲存，并避免長時間暴露在光線下。不要凍結。

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