Ishikawa(Heraklio) 02 ER人星形細胞瘤

關于培養瓶內加入培養基的量的問題。
這個是要靠自己去摸索你所養的細胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些細胞反而是培養基少一點相反細胞形態會長得比較好。（可能也是競爭很大，有優勝劣汰吧。呵呵。）對于生長速度快的細胞，易生長的細胞加少一點培養基細胞形態會更好。但是要注意換液掌握。
關于選擇培養瓶的問題。
個人發現生長速度快的細胞在玻璃瓶內生長的狀態會比一次性塑料瓶相對好一些。而對于同一種細胞，在其生長旺盛快速的時期在玻璃瓶內的生長狀態也比塑料瓶內好。這可能是因為塑料瓶比玻璃瓶更容易貼壁。生長速度快的細胞在塑料瓶這種相對“更安逸”的環境里反而長得狀態不如玻璃瓶好。
所以對于生長速度慢的細胞如果想要更漂亮的細胞狀態，塑料瓶比玻璃瓶會好，對于生長速度慢的細胞，玻璃瓶則會更好。同樣，對于同一種細胞，在其生長速度慢的時候，塑料瓶會好一點，比如剛剛復蘇的時候，或者原代培養的時候。而在其生長旺盛的時候，玻璃瓶則相對會好一點。

Ishikawa(Heraklio) 02 ER人星形細胞瘤

消化/傳代。

1、移去MEF培養基

2、用5ml不含鈣鎂離子的PBS洗滌細胞(以去除胰蛋白酶的抑制物)。

3、每個培養瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA(0.05%的胰蛋白酶)，消化5min。

4、為了使細胞分散開，輕輕吹打細胞。

5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培養基以終止胰蛋白酶的消化。

6、將細胞懸液加入到15ml的錐形管中，吹打幾次，使細胞分散為單個的。

7、在新的T75培養瓶中加入10mlMEF培養基。

8、將細胞懸液分裝到新的T75培養瓶中，放在37℃培養箱中進行培養。

細胞傳代培養的胰酶消化法：

傳代培養：是指細胞從一個培養瓶以1：2或1：2以上的比例轉移，接種到另一培養瓶的培養。傳代細胞，可根據不同細胞采取不同的方法進行細胞傳代。貼壁生長的細胞用消化法傳代，部分貼壁的細胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細胞可采用加入等量新鮮培養基后直接吹打分散進行傳代，或用自然沉降法加入新培養基后再吹打分散進行傳代。

實驗步驟：① 入無菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒雙手;

② 倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞是否傳代及細胞需要稀釋的倍數。將培養用液37℃下預熱。

③ 超凈臺臺面應整潔，用75%酒精棉球擦拭清潔;

④ 打開超凈工作臺的紫外燈照射臺面20min左右，關閉紫外燈，打開風機清潔空氣除去臭氧;

⑤ 點燃酒精燈;取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮頭;過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內。

⑥ 將培養用液瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。

⑦ 倒掉培養細胞的舊培養基。酌情可用2-3ml Hanks液洗去殘留的就培養基，或用少量胰酶涮洗一下。

⑧ 每個大培養瓶加入1ml胰酶，小培養瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察。當細胞收回突起變圓時立即翻轉培養瓶，使細胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細胞提早脫落入消化液中。

⑨ 加入少量的含血清的新鮮培養基，反復吹打消化好的細胞使其脫壁并分散，再根據分傳瓶數補加一定量的含血清的新鮮培養基(7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶)制成細胞懸液，然后分裝到新培養瓶中。蓋好瓶蓋，適度擰緊后稍回轉，以利于CO2的進入，將培養瓶放回CO2培養箱。

⑩ 對懸浮培養細胞，步驟7-9不做。直接將細胞懸液進行離心去除舊培養基上清，加入新鮮培養基，然后分裝到各瓶中。